Как известно, основную долю информации об окружающем мире человек получает с помощью зрения. Глаз человека - сложный и совершенный прибор. Этот созданный природой прибор работает со светом - электромагнитным излучением, диапазон длин волн которого находится между 400 и 760 нанометрами. Цвет, который при этом воспринимает человек, изменяется от фиолетового до красного.
Электромагнитные волны, соответствующие видимому свету, взаимодействуют с электронными оболочками атомов и молекул глаза. Результат этого взаимодействия зависит от того, в каком состоянии находятся электроны этих оболочек. Свет может поглощаться, отражаться или рассеиваться. Что именно произошло со светом, может многое рассказать об атомах и молекулах, с которыми он взаимодействовал. Диапазон размеров атомов и молекул от 0,1 до десятков нанометров. Это во много раз меньше, чем длина волны света. Тем не менее, объекты именно таких размеров - назовем их нанообъектами - очень важно увидеть. Что же надо для этого сделать? Обсудим сначала, что может рассмотреть человеческий глаз.
Обычно, когда говорят о разрешающей способности того или иного оптического прибора, оперируют двумя понятиями. Одно из них - угловое разрешение, а второе - линейное разрешение. Эти понятия взаимосвязаны. К примеру, для человеческого глаза угловое разрешение составляет приблизительно 1 угловую минуту. При этом глаз может различить два точечных объекта, удаленных от него на 25–30 см, только тогда, когда расстояние между этими объектами больше чем 0,075 мм. Это вполне сравнимо с разрешением обычного компьютерного сканера. В самом деле, разрешение 600 точек на дюйм означает, что сканер может различить точки, расположенные на расстоянии 0,042 мм друг от друга.
Для того чтобы можно было различать объекты, расположенные на еще меньших расстояниях друг от друга, был придуман оптический микроскоп - прибор, увеличивающий разрешающую способность глаза. Выглядят эти приборы по-разному (что видно из рисунка 1), но принцип действия у них один тот же. Оптический микроскоп позволил отодвинуть предел разрешения до долей микрона. Уже 100 лет назад оптическая микроскопия сделала возможным изучать объекты микронных размеров. Однако тогда же стало ясно, что простым увеличением количества линз и улучшением их качества добиться дальнейшего увеличения разрешающей способности невозможно. Разрешение оптического микроскопа оказалось ограничено свойствами самого света, а именно его волновой природой.
Еще в конце позапрошлого века было установлено, что разрешение оптического микроскопа составляет . В этой формуле λ - длина волны света, а n sin u - числовая апертура объектива микроскопа, которая характеризует как микроскоп, так и то вещество, которое находится между объектом изучения и самой близкой к нему линзой микроскопа. И действительно, в выражение для числовой апертуры входят показатель преломления n среды, находящейся между объектом и объективом, и угол u между оптической осью объектива и самыми крайними лучами, которые выходят из объекта и могут попасть в этот объектив. Показатель преломления вакуума равен единице. У воздуха этот показатель очень близок к единице, у воды он составляет 1,33303, а у специальных жидкостей, используемых в микроскопии для получения максимального разрешения, n доходит до 1,78. Каким бы ни был угол u , величина sin u не может быть больше единицы. Таким образом, разрешение оптического микроскопа не превышает долей длины волны света.
Обычно считается, что разрешение составляет половину длины волны.
Интенсивность, разрешение и увеличение объекта - разные вещи. Можно сделать так, что расстояние между центрами изображений объектов, которые расположены в 10 нм друг от друга, будет 1 мм. Это будет соответствовать увеличению в 100 000 раз. Тем не менее, различить, один это объект или два, не получится. Дело в том, что изображения объектов, размеры которых очень малы по сравнению с длиной волны света, будут иметь одинаковые форму и размеры, не зависящие от формы самих объектов. Такие объекты называют точечными - их размерами можно пренебречь. Если такой точечный объект светится, то оптический микроскоп изобразит его в виде светлого кружка, окруженного светлыми и темными кольцами. Будем далее, для простоты, рассматривать именно источники света. Типичное изображение точечного источника света, полученное с помощью оптического микроскопа, показано на рисунке 2. Интенсивность светлых колец намного меньше, чем у кружочка, и убывает по мере удаления от центра изображения. Чаще всего видно только первое светлое кольцо. Диаметр первого темного кольца равен . Функция, которая описывает такое распределение интенсивности, называется функцией рассеяния точки. Эта функция не зависит от того, каково увеличение. Изображение нескольких точечных объектов будет представлять собой именно круги и кольца, как это видно из рисунка 3. Полученное изображение можно увеличивать, однако если изображения двух соседних точечных объектов сливаются, то они будут сливаться и дальше. Такое увеличение часто называют бесполезным - большие изображения просто будут более размытыми. Пример бесполезного увеличения показан на рисунке 4. Формула часто называется дифракционным пределом, и она настолько знаменита, что именно ее высекли на памятнике автору этой формулы - немецкому физику-оптику Эрнсту Аббе.
Конечно, со временем оптические микроскопы стали снабжать разнообразными устройствами, позволяющими запоминать изображения. Человеческий глаз дополнили сначала пленочные фото- и кинокамеры, а потом - камеры, в основе которых лежат цифровые устройства, преобразующие попадающий на них свет в электрические сигналы. Самыми распространенными из таких устройств являются ПЗС-матрицы (ПЗС расшифровывается как прибор с зарядовой связью). Количество пикселей в цифровых камерах продолжает расти, однако само по себе это не может улучшить разрешение оптических микроскопов.
Еще двадцать пять лет назад казалось, что дифракционный предел непреодолим и что, для того чтобы изучать объекты, размеры которых во много раз меньше, чем длина волны света, необходимо отказаться от света как такового. Именно таким путем пошли создатели электронных и рентгеновских микроскопов. Несмотря на многочисленные преимущества таких микроскопов, задача использования именно света для рассматривания нанообъектов оставалась. Причин для этого было много: удобство и простота работы с объектами, небольшое время, которое требуется для получения изображения, известные способы окрашивания образцов и многое другое. Наконец, после долгих лет напряженной работы стало возможным рассматривать нанообъекты с помощью оптического микроскопа. Наибольший прогресс в этом направлении достигнут в области люминесцентной микроскопии. Конечно, дифракционный предел никто не отменял, но его удалось обойти. В настоящее время существуют различные оптические микроскопы, позволяющие рассматривать объекты, размеры которых намного меньше длины волны того самого света, который создает изображения этих объектов. Все эти приборы объединяет один общий принцип. Попробуем пояснить, какой именно.
Из того, что уже говорилось о дифракционном пределе разрешения, ясно, что увидеть точечный источник не так уж сложно. Если этот источник обладает достаточной интенсивностью, его изображение будет отчетливо видно. Форма и размер этого изображения, как уже говорилось, будут определяться свойствами оптической системы. При этом, зная свойства оптической системы и будучи уверенными в том, что объект точечный, можно определить, где именно находится объект. Точность определения координат такого объекта достаточно высока. Иллюстрацией этого может служить рисунок 5. Координаты точечного объекта можно определить тем точнее, чем интенсивнее он светится. Еще в 80-х годах прошлого века с помощью оптического микроскопа умели определять положение отдельных светящихся молекул с точностью в 10–20 нанометров. Необходимым условием столь точного определения координат точечного источника является его одиночество. Ближайший к нему другой точечный источник должен находиться настолько далеко, чтобы исследователь точно знал, что обрабатываемое изображение соответствует одному источнику. Понятно, что это расстояние l должно удовлетворять условию . В этом случае анализ изображения может дать очень точные данные о положении самого источника.
Большинство объектов, размеры которых намного меньше разрешающей способности оптического микроскопа, можно представить как набор точечных источников. Источники света в таком наборе находятся друг от друга на расстояниях, намного меньших величины . Если эти источники будут светить одновременно, то сказать что-либо о том, где именно они расположены, будет невозможно. Тем не менее, если суметь заставить эти источники светить по очереди, то положение каждого них можно определить с высокой точностью. Если эта точность превышает расстояние между источниками, то, обладая знанием о положении каждого из них, можно узнать о том, каково их взаимное расположение. А это означает, что получена информация о форме и размерах объекта, который представлен как набор точечных источников. Другими словами, в таком случае можно рассмотреть в оптический микроскоп объект, размеры которого меньше, чем дифракционный предел!
Таким образом, ключевым моментом является получение информации о различных частях нанообъекта независимо друг от друга. Существуют три основные группы методов, позволяющие сделать это.
Первая группа методов целенаправленно заставляет светить ту или иную часть исследуемого объекта. Самый известный из этих методов - сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля. Рассмотрим ее подробнее.
Если внимательно изучить те условия, которые подразумеваются, когда речь идет о дифракционном пределе, обнаружится, что расстояния от объектов до линз значительно больше длины волны света. На расстояниях, сравнимых и меньших этой длины волны, картина получается другой. Вблизи любого объекта, попавшего в электромагнитное поле световой волны, существует переменное электромагнитное поле, частота изменения которого такая же, как частота изменения поля в световой волне. В отличие от световой волны, это поле быстро затухает по мере удаления от нанообъекта. Расстояние, на котором происходит уменьшение интенсивности, например, в e раз, сравнимо с размерами объекта. Таким образом, электромагнитное поле оптической частоты оказывается сконцентрированным в объеме пространства, размер которого намного меньше, чем длина волны света. Любой нанообъект, попавший в эту область, будет так или иначе взаимодействовать со сконцентрированным полем. Если тот объект, с помощью которого осуществляется это концентрирование поля, последовательно перемещать по какой-либо траектории вдоль изучаемого нанообъекта и регистрировать свет, излучаемый этой системой, то можно построить изображение по отдельным точкам, лежащим на этой траектории. Конечно, в каждой точке изображение будет выглядеть так, как показано на рисунке 2, но разрешение при этом будет определяться тем, насколько удалось сконцентрировать поле. А это, в свою очередь, определяется размерами того объекта, с помощью которого это поле концентрируется.
Самым распространенным способом такой концентрации поля является изготовление очень маленького отверстия в металлическом экране. Обычно это отверстие находится на конце заостренного и покрытого тонкой пленкой металла световода (световод часто называется оптическим волокном и широко используется для передачи данных на большие расстояния). Сейчас удается изготавливать отверстия с диаметрами от 30 до 100 нм. Таким же по величине получается и разрешение. Приборы, работающие по этому принципу, и называются сканирующими оптическими микроскопами ближнего поля. Они появились 25 лет тому назад.
Суть второй группы методов сводится к следующему. Вместо того чтобы заставлять соседние нанообъекты светить по очереди, можно использовать объекты, которые светятся разными цветами. В этом случае с помощью светофильтров, пропускающих свет того или иного цвета, можно определять положение каждого из объектов, а потом - составлять единую картину. Это очень похоже на то, что изображено на рисунке 5, только цвета для трех изображений будут различными.
Последняя группа методов, позволяющих преодолеть дифракционный предел и рассмотреть нанообъекты, использует свойства самих светящихся объектов. Существуют такие источники, которые можно «включать» и «выключать» с помощью специально подобранного света. Такие переключения происходят статистически. Иначе говоря, если имеется много переключаемых нанообъектов, то, подобрав длину волны света и его интенсивность, можно заставить «выключиться» только часть из этих объектов. Остальные объекты будут продолжать светить, и можно получить от них изображение. После этого надо «включить» все источники и снова «выключить» часть из них. Набор оставшихся «включенными» источников будет отличаться от набора, который остался «включенным» в первый раз. Повторяя такую процедуру много раз, можно получить большой набор изображений, отличающихся друг от друга. Анализируя такой набор, можно установить местоположение большой доли всех источников с очень высокой точностью, значительно превышающей дифракционный предел. Пример сверхразрешения, полученного таким способом, приведен на рисунке 6.
В настоящее время оптическая микроскопия со сверхразрешением быстро развивается. Можно со всей уверенностью предполагать, что в грядущие годы эта область будет привлекать все большее число исследователей, и хочется верить, что среди них будут и читатели этой статьи.
к. т. н. Егорова О.В.,
эксперт Госстандарта РФ по оптическим приборам
Микроскоп является одним из основных приборов при проведении цитологических исследований. Качество его работы, как сложной оптической системы, определяется технологическими особенностями прибора и его элементов. Качество же изображения в первую очередь определяется природой построения изображения препарата световым потоком, прошедшим через него. По теории образования изображения в микроскопе, созданной на предприятии Карла Цейсса математиком и физиком Эрнстом Аббе (1840-1905) [показать] в 1872 году, изображение является совокупностью дифракционного и интерференционного свойства света.
2005 год объявлен годом Аббе за вклад в развитие оптического приборостроения и за организацию Фонда "Carl ZEISS", объединившего приборостроительный завод "Zeiss" и завод по производству стекла "Schott".
Оба эти свойства влияют на качество изображения и на точность воспроизведения объекта в изображении, а Август Келер (1866-1948) в 1883 году опубликовал предписания по правильному освещению микроскопических препаратов.
С другой стороны, качество изображения оптической системы зависит и от ее технологического совершенства (наличия остаточных аберраций - искажений, дефектов стекла), сборки и центрировки.
Важной количественной характеристикой качества изображения служит разрешающая способность. Остаточные искажения вызывают перераспределение световой энергии в дифракционной картине, а внутренние дефекты объектива (и всей оптической системы микроскопа) приводят к образованию вредного рассеянного света и геометрического искажения дифракционной картины, накладывающихся на оптическое изображение, что снижает разрешающую способность и контраст изображения.
Разрешающей способностью оптической системы называется ее свойство изображать раздельно две точки или две линии, расположенные в пространстве предметов. Мерой разрешающей способности служит наименьшее линейное или угловое расстояние между двумя точками (линиями), изображения которых раздельно строятся оптической системой.
Оптическую систему принято считать совершенной, если разрешающая способность ограничена только дифракцией света на краях оправы объектива или апертурной диафрагмы конденсора. Дифракция света, обусловленная волновой природой света, нарушает прямолинейное распространение света; светящаяся точка изображается в виде круглого пятна, называемого кружком Эри, окруженного темными и светлыми кольцами убывающей яркости. Около 84% световой энергии сконцентрировано в центральном пятне, 7% - внутри первого светлого пятна и 9% - в остальных кольцах. Радиус р (рис. 1) первого темного кольца в плоскости изображения определяется выражением р = 1,22λ f , / D (1), где λ - длина волны света; f , - фокусное расстояние оптической системы; D - диаметр действующего отверстия системы (апертуры).
Величина р равна расстоянию между центрами изображения двух точек А и В; р можно определить по формуле р = 0,61λ / sin σ , , (2), где σ , - апертурный угол в пространстве изображений.
При λ = 0,560 мкм = 560 нм р = 0,34 / σ , где р измеряется в микрометрах.
Изображения двух светящихся точек, построенные оптической системой, представляют собой два пятна с нерезкими краями. По мере сближения точек пятна соприкасаются, потом перекрываются и затем сливаются (рис. 1).
Глаз может видеть две точки в плоскости изображения раздельно при некотором минимальном расстоянии р между ними и необходимой разности освещенностей в точке минимума а и максимумов А или В. Контрастная чувствительность для среднего глаза равна 5%. Отношение освещенности в точке а к освещенности в точке А или В достигает 85%.
Разрешающую способность оптических систем определяют с помощью штриховых или радиальных мир, выполненных на стеклянных пластинках (рис. 2). На темном фоне фотолитографическим способом нанесены светлые штрихи или сектора. Выпускают стандартные штриховые миры шести номеров (для оценки разрешающей способности объективов фотоаппаратов и других оптических приборов и узлов) и миру № 0 для автоколлимационной оценки разрешающей способности объективов микроскопа. Каждая мира состоит из 25 элементов, оцифрованных по краям и имеющих по четыре группы штрихов с шириной штриха, меняющейся от одного элемента к другому. Под шириной штриха понимают осевое расстояние между двумя соседними темными или светлыми полосами, т. е. суммарная ширина темной и светлой полос равна ширине одного штриха. Все стандартные миры имеют абсолютный контраст К = 1.
Разрешающую способность объектива микроскопа определяют в линейной мере. Для несамосветящихся объектов предел разрешения d = λ / A (3), где А - числовая апертура, равная произведению показателя преломления п среды между объективом и предметом и sin σ .
При наблюдении периодической структуры наименьшее расстояние d , согласно теории Аббе, зависит от апертуры объектива и апертуры конденсора: d = λ / (A + A k) , (4), где A k - числовая апертура конденсора.
Если апертура конденсора равна апертуре объектива, то разрешающая способность микроскопа для самосветящихся объектов определяется формулой d = λ / (2A) (5)
| Таблица 1. Расчетные значения разрешающей способности объективов | |||||||
| А об | λ = 400 нм | λ = 550 нм | λ = 700 нм | ||||
| Р 1 | Р 2 | Р 1 | Р 2 | Р 1 | Р 2 | ||
| 0,025 | 8,0 | 9,76 | 11,0 | 17,08 | 13,42 | 14,0 | |
| 0,075 | 2,67 | 3,25 | 3,67 | 5,69 | 4,47 | 4,67 | |
| 0,10 | 2,0 | 2,44 | 2,75 | 4,27 | 3,36 | 3,5 | |
| 0,12 | 1,67 | 2,03 | 2,29 | 3,56 | 2,8 | 2,92 | |
| 0,20 | 1,0 | 1,22 | 1,3 | 1,67 | 1,75 | 2,13 | |
| 0,25 | 0,8 | 0,98 | 1,10 | 1,71 | 1,34 | 1,4 | |
| 0,30 | 0,67 | 0,81 | 0,92 | 1,42 | 1,12 | 1,17 | |
| 0,40 | 0,5 | 0,61 | 0,66 | 1,07 | 0,84 | 0,87 | |
| 0,45 | 0,44 | 0,54 | 0,62 | 0,95 | 0,74 | 0,78 | |
| 0,50 | 0,4 | 0,49 | 0,55 | 0,85 | 0,67 | 0,7 | |
| 0,65 | 0,31 | 0,37 | 0,42 | 0,66 | 0,52 | 0,54 | |
| 0,75 | 0,27 | 0,32 | 0,36 | 0,57 | 0,45 | 0,47 | |
| 0,80 | 0,25 | 0,305 | 0,34 | 0,53 | 0,42 | 0,44 | |
| 0,85 | 0,23 | 0,29 | 0,32 | 0,5 | 0,39 | 0,41 | |
| 0,90 | 0,22 | 0,27 | 0,31 | 0,47 | 0,37 | 0,39 | |
| 0,95 | 0,21 | 0,26 | 0,29 | 0,45 | 0,35 | 0,37 | |
| 1,0 | 0,126 | 0,126 | 0,174 | 0,221 | 0,174 | 0,221 | |
| 1,20 | 0,105 | 0,105 | 0,145 | 0,184 | 0,145 | 0,184 | |
| 1,25 | 0,101 | 0,101 | 0,139 | 0,177 | 0,139 | 0,177 | |
| 1,30 | 0,097 | 0,097 | 0,134 | 0,17 | 0,134 | 0,17 | |
| 1,40 | 0,09 | 0,09 | 0,124 | 0,158 | 0,124 | 0,158 | |
| 1,45 | 0,087 | 0,087 | 0,120 | 0,152 | 0,120 | 0,152 | |
| Р 1 - расчет по формуле (5) | Р 2 - расчет по формуле (2) | ||||||
Следует отметить, что чем более тонкие исследования проводятся, тем более сопоставимым должно быть расчетное качество объектива и конденсора (осветительной системы). Например, новые исследовательские и универсальные микроскопы "Axio Imager" имеют принципиальный расчет IC2S оптики, уравнивающий качество объектива и осветительной системы.
Из приведенных формул следует, что чем короче длина волны света и больше апертура объектива, тем выше разрешающая способность объектива микроскопа.
Для увеличения разрешающей способности микроскопа можно использовать иммерсионные жидкости, которые заполняют пространство между рассматриваемым предметом и объективом микроскопа. Благодаря этому числовая апертура объектива микроскопа может быть доведена до 1,45, а предельное разрешаемое расстояние при λ = 0,56 мкм - до d = 0,17 мкм.
На повышение разрешающей способности влияет соотношение светового потока, прошедшего через препарат (апертура конденсора) и воспринятого объективом (апертура объектива). Если препарат контрастный (после проведенной обработки и окраски соответствующим способом), то по принципу Келера при настройке освещения допустимо раскрытие апертурной диафрагмы конденсора до величины числовой апертуры объектива или с помощью ирисовой диафрагмы размер апертурной диафрагмы конденсора может быть уменьшен на 1/3.
Таким образом, величина разрешающей способности может быть рассчитана как по формуле (5), так и по формуле (2) соответственно. Поэтому при работе с объективом А = 1,25 можно применять конденсор как с числовой апертурой А = 0,9 (сухой, разрешающая способность рассчитывается по формуле 2), так и А = 1,25 (иммерсионный, разрешающая способность рассчитывается по формуле 5), при этом не забываем, что для получения А = 1,25 на конденсор необходимо "капать" иммерсионное масло.
В табл. 1 представлены расчетные значения разрешающей способности объективов, традиционно применяемых для медико-биологических исследований.
На рис. 3 представлены примеры изображений при правильно настроенном микроскопе (а) и при неправильной настройке осветительной системы микроскопа (б, в). Как видно, неправильная настройка влияет на разрешающую способность микроскопа, а также на точность передачи элементов препарата в его изображении.
Как уже было сказано, разрешение может быть повышено за счет применения цветных светофильтров. Традиционными являются синий, зеленый, желтый и красный. Однако если синий и зеленый действительно влияют на повышение разрешающей способности, то желтый и красный работают на повышение контраста, т. е. усиливают разницу между средой и препаратом.
Таким образом, на разрешающую способность в микроскопе влияют:
Источник : И.П. Шабалова, Т.В.Джангирова, Н.Н.Волченко, К.К.Пугачев. Цитологический атлас: Диагностика заболеваний молочной железы.- М.-Тверь: ООО "Издательство "Триада", 2005
Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые
микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры
не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т. п.) a электронные для изучения
более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бактерий.
Современные световые микроскопы
- это сложные оптические
приборы, обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и большой
аккуратности.
Световые микроскопы подразделяются на студенческие, рабочие, лабораторные
и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой.
Отечественные микроскопы (Биолам", "Бимам", "Микмед")
имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С - студенческие,
Р - рабочие, Л - лабораторные, И - исследовательские), комплектация обозначается
цифрой.
В микроскопе различают механическую и оптическую части.
К механической части
относятся: штатив (состоящий из основания
и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления
и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления
конденсора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого
(макромеханизм, макровинт) и тонкого
(микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.
Оптическая часть
микроскопа представлена объективами, окулярами
и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных
под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую
сторону, а также отдельного или встроенного осветителя. Объективы ввинчиваются
в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение,
устанавливают с противоположной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий
один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.
1.
Источник света;
2. Коллектор;
3. Ирисовая полевая диафрагма;
4. Зеркало;
5. Ирисовая аппертурная диафрагма;
6. Конденбсор;
7. Препарат;
7". Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое; объективом;
7"". Увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в
окуляре;
8. Объектив;
9. выходной значок объектива;
10. Полевая диафрагма окуляра;
11. Окуляр;
12. Глаз.
Основную роль в получении изображения играет объектив
. Он
строит увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем
это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр,
который аналогично обычной лупе дает увеличенное мнимое изображение.
Увеличение
микроскопа ориентировочно можно определить, умножая
увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не определяет
качества изображения. Качество изображения, его четкость, определяется разрешающей
способностью микроскопа
, т. е. возможностью различать раздельно две
близко расположенные точки. Предел разрешения
- минимальное
расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно,- зависит от длины волны
света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива. Числовая
апертура, в свою очередь, зависит от угловой апертуры объектива и показателя
преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и препаратом.
Угловая апертура-это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив
лучи, прошедшие через объект. Чем больше апертура и чем ближе показатель преломления
среды, находящейся между объективом и препаратом, к показателю преломления
стекла, тем выше разрешающая способность объектива. Если считать апертуру
конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет
следующий вид:
где R - предел разрешения; - длина волны; NA - числовая апертура.
Различают полезное
и бесполезное
увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива,
увеличенной в 500-1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет
новых деталей и является бесполезным.
В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают
«сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с
максимальной апертурой и увеличением (90-100 х). «Сухой» объектив - это такой
объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом, находится воздух.
Особенностью иммерсионных объективов является то, что между
фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость,
имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему),
что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива.
В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют
дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии-кедровое масло или
специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического
иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно
нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной
линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра,
в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин. Ни в коем случае нельзя
пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом.
**Изображение, полученное с помощью линз, обладает различными недостатками:
сферической и хроматической аберрациями, кривизной поля изображения и др.
В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки в той или иной
мере исправлены. В зависимости от степени исправления этих недостатков различают
объективы ахроматы и более сложные апохроматы. Соответственно объективы, в
которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и
планапохроматами. Использование этих объективов позволяет получить резкое
изображение по всему полю, тогда как изображение, полученное с помощью обычных
объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения.
Все характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное
увеличение, апертура, тип объектива (АПО - апохромат и т. п.); объективы водной
иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части,
объективы масляной иммерсии-обозначение МИ и черное кольцо.
Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17мм.
Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе
с сильными сухими системами (40 х). При работе с иммерсионными объективами
нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм потому, что толщина
покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива,
и в этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может быть
повреждена фронтальная линза объектива.
Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из которых
применяется с определенным типом объектива, дополнительно устраняя недостатки
изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.
Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусировать на препарате свет от
осветителя, направляемый зеркалом микроскопа или осветителя (в случае использования
накладного или встроенного осветителя). Одной из деталей конденсора является
апертурная диафрагма, которая имеет важное значения для правильного освещения
препарата.
Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания с толстой нитью, трансформатора,
коллекторной линзы и полевой диафрагмы, от раскрытия, которой зависит диаметр
освещенного поля на препарате. Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор.
Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор,
необходимо использовать только плоскую сторону зеркала.
Качество изображения в значительной мере зависит также от
правильного освещения. Существует несколько различных способов освещения препарата
при микроскопии. Наиболее распространенным является способ установки
света по Келеру
, который заключается в следующем:
1) устанавливают осветитель против зеркала микроскопа;
2) включают лампу осветителя и направляют свет на плоское (!) зеркало микроскопа;
3)помещают препарат на предметный столик микроскопа;
4) закрывают зеркало микроскопа листком белой бумаги и фокусируют на нем изображение
нити лампы, передвигая патрон лампы в осветителе;
5) убирают лист бумаги с зеркала;
6) закрывают апертурную диафрагму конденсора. Перемещая зеркало и слегка передвигая
патрон лампы, фокусируют изображение нити на апертурной диафрагме. Расстояние
осветителя от микроскопа должно быть таким, чтобы изображение нити лампы было
равно диаметру апертурной диафрагмы конденсора (наблюдать апертурную диафрагму
можно с помощью плоского зеркала, помещенного с правой стороны основания микроскопа).
7)открывают апертурную диафрагму конденсора, уменьшают отверстие полевой диафрагмы
осветителя и значительно уменьшают накал лампы;
8) при малом увеличении (10х), глядя в окуляр, получают резкое изображение
препарата;
9)слегка поворачивая зеркало, переводят изображение полевой диафрагмы, которое
имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая конденсор,
добиваются получения резкого изображения краев полевой диафрагмы в плоскости
препарата (вокруг них может быть видна цветная каемка);
10) раскрывают полевую диафрагму осветителя до краев поля зрения, увеличивают
накал нити лампы и слегка (на 1/3) уменьшают раскрытие апертурной диафрагмы
конденсора;
11)при смене объектива необходимо проверить настройку света.
После окончания настройки света по Келеру нельзя изменять положение конденсораf
раскрытие полевой и апертурной диафрагмы. Освещенность препарата можно регулировать
только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата.
Излишнее открытие апертурной диафрагмы конденсора может привести к значительному
снижению контраста изображения, а недостаточное - к значительному ухудшению
качества изображения (появлению диффракционных колец). Для проверки правильности
раскрытия апертурной диафрагмы необходимо удалить окуляр и, глядя в тубус,
открыть ее таким образом, чтобы она закрывала светящееся поле на одну треть.
Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения
(до 10х) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.
Внимание! При работе с объективами, дающими большое увеличение - с сильными
сухими (40х) и иммерсионными (90х) системами, чтобы не повредить фронтальную
линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая сбоку, опускают
объектив макровинтом почти до соприкосновения с препаратом, затем, глядя в
окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения
и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.
При работе с микроскопом нельзя применять большие усилия.
Нельзя касаться пальцами поверхности линз, зеркал и светофильтров.
Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы тубуса
от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе. При чистке
внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой
в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной,
не содержащей остатков мыла, полотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной
чистым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики. Не рекомендуется
протирать оптику объективов ксилолом, так как это может привести к их расклеиванию.
С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее
резиновой грушей. Протирать их нельзя. Нельзя также самостоятельно развинчивать
и разбирать объективы - это приведет к их порче. По окончании работы на микроскопе
необходимо тщательно удалить остатки иммерсионного масла с фронтальной линзы
объектива указанным выше способом. Затем опустить предметный столик (или конденсор
в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.
Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо периодически протирать
его мягкой тряпкой, слегка пропитанной бескислотным вазелином и затем сухой
мягкой чистой тряпкой.
Помимо обычной световой микроскопии существуют методы микроскопии, позволяющие изучать неокрашенные микроорганизмы: фазово-контрастная , темнопольная и люминесцентная микроскопия. Для изучения микроорганизмов и их структур, размер которых меньше разрешающей способности светового микроскопа используют
Технически возможно создать оптические микроскопы, объективы и окуляры которых дадут общее увеличение 1500-2000 и больше. Однако это нецелесообразно, так как возможность различить мелкие детали предмета ограничивается дифракционными явлениями. Вследствие этого изображение мельчайших деталей предмета теряет резкость, может возникнуть нарушение геометрического подобия изображения и предмета, соседние точки будут сливаться в одну, возможно полное исчезновение изображения. Поэтому в оптике существуют следующие понятия, которые характеризуют качество микроскопа:
Разрешающая способность микроскопа - свойство микроскопа давать раздельно изображение мелких деталей рассматриваемого предмета.
Предел разрешения - это наименьшее расстояние между двумя точками, которые видны в микроскопе раздельно.
Чем меньше предел разрешения, тем выше разрешающая способность микроскопа!
Предел разрешения обусловливает наименьший размер деталей, которые могут различаться в препарате с помощью микроскопа.
Теорию разрешающей способности микроскопа разработал директор завода К.Цейса в Йене профессор-оптик Э.Аббе (1840-1905). В качестве простейшего микропрепарата он взял дифракционную решетку (рис. 2), изучил механизм формирования изображения в микроскопе и показал следующее.
Введем понятиеапертурного угла - это угол между крайними лучами конического светового пучка, идущего от середины объекта в объектив (рис. 3,а ). Для создания изображения, то есть для разрешения объекта, достаточно, чтобы в объектив попали лучи, образующие максимумы только нулевого и первого порядка хотя бы с одной стороны (рис. 2 и 3,б ). Участие в образовании изображения лучей от большего количества максимумов повышает качество изображения, его контраст. Поэтому лучи, образующие эти максимумы, должны быть в пределах апертурного угла объектива.
 |
а) б) в) г)
1- фронтальная линза объектива, 2 - объектив
Таким образом, если объектом является дифракционная решетка с периодом d и свет падает на нее нормально (рис.2 и 3,б ), то в формировании изображения обязательно должны участвовать лучи, образующие максимумы нулевого и первого порядков с обеих сторон, а угол j 1 - угол отклонения лучей, образующих максимум первого порядка, соответственно должен быть, в крайнем случае, равен углу U /2.
Если же взять решетку с меньшим периодом d ’, то угол j’ 1 будет больше угла U /2 и изображение не возникнет. Значит период решетки d можно принять за предел разрешения микроскопа Z . Тогда, используя формулу дифракционной решетки, запишем для k =1:
Заменяя d на Z , а j 1 на U /2, получим
. (6)
Во время микроскопии световые лучи падают на объект под разными углами. При наклонном падении лучей (рис.3,г ) предел разрешения уменьшается, так как в формировании изображения будут участвовать только лучи, образующие максимумы нулевого порядка и первого порядка с одной стороны, а угол j 1 будет равен апертурному углу U . Расчеты показывают, что формула для предела разрешения в этом случае принимает следующий вид:
. (7)
Если пространство между объектом и объективом заполнить иммерсионной средой с показателем преломления n , который больше показателя преломления воздуха, то длина волны света l n = l ¤ n . Подставляя это выражение в формулу для предела разрешения (7), получим
, или 
. (8)
Таким образом, формула (7) определяет предел разрешения для микроскопа с сухим объективом, а формула (8) -для микроскопа с иммерсионным объективом. Величины sin 0,5U и n× sin0,5U в этих формулах называют числовой апертурой объектива и обозначают буквой А . Учитывая это, формулу предела разрешения микроскопа в общем виде записывают так:
Как видно из формул (8) и (9), разрешающая способность микроскопа зависит от длины волны света, величины апертурного угла, показателя преломления среды между объективом и объектом, угла падения световых лучей на объект, но она не зависит от параметров окуляра. Окуляр никакой дополнительной информации о структуре объекта не дает, качества изображения не повышает, он лишь увеличивает промежуточное изображение.
Разрешающая способность микроскопа может быть повышена за счет использования иммерсии и уменьшения длины волны света. Повышение разрешающей способности при использовании иммерсии можно пояснить следующим образом. Если между объективом и объектом находится воздух (сухой объектив), то световой луч при переходе из покровного стекла в воздух, среду с меньшим показателем преломления, значительно изменяет свое направление в результате преломления, поэтому меньше лучей попадает в объектив. При использовании иммерсионной среды, показатель преломления которой приблизительно равен показателю преломления стекла, изменение хода лучей в среде не наблюдается и большее количество лучей попадает в объектив.
В качестве иммерсионной жидкости берут воду (n =1,33), кедровое масло (n =1,515) и др. Если максимальный апертурный угол у современных объективов достигает 140 0 , то для сухого объектива А =0,94, а для объектива с масляной иммерсией А =1,43. Если при расчете использовать длину волны света l = 555 нм, к которой наиболее чувствителен глаз, то предел разрешения сухого объектива составит 0,30 мкм, а с масляной иммерсией - 0,19 мкм. Значение числовой апертуры указывается на оправе объектива: 0,20; 0,40; 0,65 и др.
Повышение разрешающей способности оптического микроскопа за счет уменьшения длины волны света достигается при использовании ультрафиолетового излучения. Для этого имеются специальные ультрафиолетовые микроскопы с кварцевой оптикой и приспособлениями для наблюдения и фотографирования объектов. Так как в этих микроскопах используется свет с длиной волны примерно в два раза меньше, чем у видимого света, то они способны разрешать структуры препарата размерами около 0,1мкм. Ультрафиолетовая микроскопия имеет еще одно преимущество - с ее помощью можно исследовать неокрашенные препараты. Большинство биологических объектов прозрачны в видимом свете, так как не поглощают его. Однако они обладают избирательным поглощением в ультрафиолетовой области и, следовательно, легко различимы в ультрафиолетовых лучах.
Наибольшая разрешающая способность у электронного микроскопа, так как длина волны при движении электрона в 1000 раз меньше длины световой волны.
Полезное увеличение микроскопа ограничено его разрешающей способностью и разрешающей способностью глаза.
Разрешающая способность глаза характеризуется наименьшим углом зрения, при котором человеческий глаз еще различает раздельно две точки предмета. Она лимитируется дифракцией на зрачке и расстоянием между светочувствительными клетками сетчатки. Для нормального глаза наименьший угол зрения равен 1 минуте. Если предмет находится на расстоянии наилучшего зрения - 25 см, то этот угол соответствует предмету размером 70 мкм. Данную величину считают пределом разрешения невооруженного глаза Z r на расстоянии наилучшего зрения. Однако показано, что оптимальная величина Z r равна 140-280 мкм. При этом глаз испытывает наименьшее напряжение.
Полезным увеличением микроскопа называют его максимальное увеличение, при котором глаз еще в состоянии различать детали, равные по величине пределу разрешения микроскопа.
Линейное увеличение микроскопа равно отношению величины изображения предмета, расположенного на расстоянии наилучшего зрения, к величине самого предмета (см. формулу 1). Если за размер предмета примем предел разрешения микроскопа Z , а за размер изображения - предел разрешения невооруженного глаза на расстоянии наилучшего зрения Z r , то получим формулу полезного увеличения микроскопа:
Подставляя в эту формулу Z из выражения (9), получим
. (11)
Подставив в формулу (11) длину волны света 555 нм (555×10 -9 м), оптимальные величины пределов разрешения глаза 140-280 мкм (140-280×10 -6 м), найдем интервал значений полезного увеличения микроскопа
500 А < К п < 1000 А .
Например, при использовании лучших иммерсионных объективов с числовой апертурой 1,43 полезное увеличение будет составлять 700-1400, отсюда видно, что конструировать оптические микроскопы с большим увеличением нецелесообразно. Однако в настоящее время этот вопрос потерял свою остроту в связи с широким использованием в биологии и медицине электронного микроскопа, обеспечивающего увеличение до 600 000, а предел разрешения - до 0,1 нм.
