Согласно определению английского физика Рэлея разрешение оптической системы естьминимальное расстояние между двумя точками формируемого ею изображения,пока они еще видны раздельно . Рэлей показал, что максимальное разрешение линзы (т.е. минимальное расстояние d между двумя соседними точками изображения) прямо пропорционально длине используемой световой волны l и обратно пропорционально показателю преломления среды n , а также углу раскрытия a :

Длина волны l равна произведению скорости света v на период колебаний T . Показатель преломления n определяется как отношение скорости света в вакууме (300000 км/сек) к скорости света v в данной среде. Для воздуха показатель преломления равен 1.0, для воды - 1.3, для кедрового масла - 1.5. Угол раскрытия a характеризует способность линзы собирать световые лучи. Он определяется как угол между двумя линиями, соединяющими край линзы с точкой ее переднего фокуса и, следовательно, зависит от диаметра линзы и ее кривизны (рис. 3). Максимальное значение a для современных объективов достигает 138 о.

Рис. 3. Угол раскрытия объектива a

Из формулы Рэлея также следует, что разрешение микроскопа можно повысить тремя способами:

1) уменьшением длины волны l (этот способ реализован в ультрафиолетовом и электронном микроскопах);

2) повышением показателя преломления среды n (иммерсионные объективы);

3) увеличением диаметра линз объектива (т.е увеличением угла a ).

Для того чтобы было удобно сравнивать разрешение различных объективов, Аббе выделил знаменатель формулы Рэлея в отдельный показатель - численную апертуру NA , после чего формула приняла следующий вид:

Численная апертура объектива NA = n * sin(a/2) характеризует его разрешающую способность вне зависимости от конструкции и применяемой длины волны. Введение усредняющего коэффициента 0.61 отражает тот факт, что максимальное разрешение обеспечивают только краевые лучи с максимальным углом a , тогда как близкие к центральному лучи дают разрешение в два раза ниже (рис 3). NA воздушных объективов всегда меньше 1
(n = 1, sin a < 1), но иммерсионные объективы могут иметь NA и больше 1. Величина численной апертуры объектива гравируется на его корпусе, что позволяет легко вычислить его номинальное разрешение, используя формулу Рэлея-Аббе. В этих расчетах обычно принимают, что средняя длина волны дневного света составляет 550 нм. Численная апертура современных иммерсионных объективов достигает значений 1.3 – 1.4. Рекорд в этой области принадлежит объективу фирмы Карл Цейсс с апертурой 1.45, который способен формировать изображения микроструктур размером 170 нм.

Кроме разрешения в плоскости препарата d (разрешения по полю), объектив микроскопа обладает также разрешением по глубине dz (Young, 1998).

Особую роль разрешение по глубине (глубина фокуса) играет в конфокальной микроскопии, где на основе оптических срезов создаются трехмерные реконструкции микроструктур и где толщина оптического среза сильно влияет на качество реконструкции. Поэтому в конфокальных микроскопах предусмотрены специальные аппаратные и программные средства, позволяющие уменьшать глубину фокуса. Как следует из формулы Янга для обычного микроскопа глубина фокуса dz почти не отличается от разрешения по полю d.

Вторым по значимости показателем объективов и окуляров является увеличение, которое также всегда указано на их оправе. Как правило, чем выше увеличение объектива, тем больше у него численная апертура (т.е. разрешение). Однако эта зависимость соблюдается не всегда - существуют объективы одного увеличения с разной и даже регулируемой апертурой, а объективы с высокой апертурой могут иметь пониженное увеличение. В связи с этим различают полезное и бесполезное увеличение , имея ввиду, что полезное увеличение связано с разрешением, а бесполезное - нет. По существу бесполезное увеличение представляет собой масштабирование изображения, при котором объем полученной информации остается прежним или даже снижается. Тем не менее, оно может понадобиться, например, при согласовании размеров поля зрения микроскопа и ПЗС-матрицы цифрового фотоаппарата.

Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива и окуляра. В некоторых микроскопах следует учитывать также увеличение дополнительных линз, встроенных в бинокулярную насадку. В микроскопах, оборудованных телекамерами или цифровыми фотоаппаратами, к оптическому увеличению добавляется еще и электронное масштабирование. Поскольку общее увеличение микроскопа в этом случае будет зависеть от многих факторов, в научных публикациях вместо него принято указывать марку микроскопа, а также увеличение и апертуру используемого объектива (например, Zeiss Axiolab, x100/1.25).

Калибровка микроскопа . Если предполагается измерять размеры клеток и других микроструктур, микроскоп необходимо прокалибровать. Калибровка микроскопа производится с помощью специального препарата - объект-микрометра. Он представляет собой предметное стекло, в центре которого нанесена шкала с делениями ценой 10 мкм (рис. 4). Встречаются также объект-микрометры в виде металлической пластины с отверстием в центре, где укреплено стекло со светлой шкалой на темном фоне. Однако, они менее удобны из-за сложности фокусировки на шкалу, особенно при недостатке света на больших увеличениях.

Для определения размеров микрообъектов используется специальный измерительный окуляр (окуляр-микрометр), в котором также имеется шкала. Принцип калибровки заключается в определении цены деления шкалы окуляр-микрометра путем совмещения ее со шкалой
объект-микрометра. Зная цену деления объект-микрометра и число его делений, приходящихся на определенное число делений окуляр-микрометра, можно, разделив первое на второе, получить калибровочный фактор . Умножение калибровочного фактора на результаты измерений
окуляр-микрометром позволит приводить их к абсолютной величине, выраженной в микрометрах. Для повышения точности измерений применяются также усовершенствованные окуляр-микрометры, которые снабжены микрометрическим винтом, передвигающим указатель в поле зрения.

Если микроскоп имеет встроенную телекамеру или цифровой фотоаппарат, его калибровку проводят следующим образом:

1. Устанавливают объект-микрометр в микроскоп таким образом, чтобы его деления занимали строго вертикальное положение.

2. Фокусируют объектив на шкалу объект-микрометра и получают ее цифровой снимок (рис. 4).

3. С помощью программы обработки изображений Scion Image (или аналогичной) получают строго горизонтальный профиль яркости вдоль шкалы.

4. Измеряют число пикселов (элементов растра) в отрезке, соединяющем два достаточно далеко отстоящих друг от друга деления шкалы.

5. Вычисляют калибровочный фактор, разделив длину отрезка (мкм) на измеренное в нем число пикселов.

Рис. 4. Шкала объект-микрометра (слева) и ее профиль яркости (справа).

Объектив х10, цена деления 10 мкм. На шкале дополнительно показана линия профиля яркости. Расстояние между крайними делениями вдоль этой линии составляет 400 мкм или 265 пикселов. Калибровочный фактор равен 1.509 (400/265).

Этот способ калибровки микроскопа проводится быстро и обладает высокой точностью (ошибка менее 1%). Естественно, калибровка должна проводиться для каждого объектива отдельно, даже если они имеют одинаковое номинальное увеличение.

Измерение разрешающей способности микроскопа. Формула Рэлея-Аббе позволяет рассчитать только номинальное (т.е. теоретически ожидаемое) разрешение объектива. Действительное разрешение объектива (и микроскопа в целом) может значительно отличаться от номинального.

Если микроскоп оборудован телекамерой или цифровым фотоаппаратом, измерение его реальной разрешающей способности не представляет большой проблемы. Для этого, однако, необходимо более подробно рассмотреть принцип его работы.

Описанная выше диффракция Френеля в виде концентрических круглых колец (рис. 1) возникает только в том случае, если световая волна обладает полной когерентностью. Обладающая частичной когерентностью система освещения микроскопа будет формировать диффракционую картину без выраженных колец. Более того, из-за неидеальности оптики обратное преобразование Фурье также даст изображение, сглаженное по сравнению с исходным. Следовательно, микроскоп вносит погрешность в процесс формирования изображения, что приводит к снижению его разрешающей способности. Для оценки этой погрешности в микроскопии применяют функцию рассеяния точки (P oint S pread F unction, PSF ) и функцию оптической передачи (O ptical T ransfer F unction, OTF ).

Рис. 5. Функция рассеяния точки (PSF ) и функция оптической передачи (OTF ). OTF является Фурье-образом PSF.

По существу, PSF представляет собой наблюдаемое в микроскоп изображение круглого отверстия минимального диаметра, которое освещено некогерентным светом, а OTF является его Фурье-образом (рис. 5). Чем меньше PSF (и больше сопряженная с ним OTF), тем выше разрешение. Таким образом, задача измерения разрешающей способности микроскопа сводится к определению его PSF (или OTF).

Существует много различных способов прямой и косвенной оценки величины PSF. Например, ее можно вычислить, если исследовать форму перепадов яркости в окрестностях границ микрообъектов. На практике, однако, наиболее простым и точным способом оценки максимального разрешения микроскопа является анализ его OTF, а не PSF.

Для того чтобы измерить разрешающую способность микроскопа при данном увеличении по OTF, необходимо:

1. Получить цифровую фотографию цитологического препарата.

2. Чтобы была возможность применить быстрый алгоритм преобразования Фурье, вырезать из нее квадратный участок, сторона которого L (в пикселах) равна степени числа 2 (128,256,512 и т. д.).

3. Выполнить прямое преобразование Фурье этого участка с помощью программы Scion Image (или аналогичной) и получить OTF микроскопа.

4. Измерить диаметр OTF (D) в пикселах (рис. 5).

5. Используя полученные параметры L и D , а также размеры ячейки матрицы камеры C в мкм, увеличение адаптера камеры Ma иувеличение объектива Mo ,рассчитать максимальное разрешение микроскопа d в нм по формуле:

Рис. 6. Изображение анафазы митоза (256х256) и его Фурье-образ.

Цифровая фотография делящейся митозом клетки корешка лука (рис. 6, слева) снята при помощи микроскопа Zeiss Axiolab, объектив x100/1.25, камера Axiocam MR с адаптером x0.63, размер ячейки ПЗС-матрицы 6.7 мкм (указан в спецификации). Фурье-образ этого снимка (рис. 6, справа) получен в программе Scion Image после кадрирования рамкой 256х256. Измеренный с помощью программы Scion Image диаметр OTF составляет 129 пикселов, рассчитанное по приведенной формуле разрешение микроскопа - 211 нм.

Точность данного метода измерения разрешающей способности микроскопа зависит, главным образом, от корректности определения диаметра OTF. Однако, как видно из профиля яркости OTF (рис. 7), ее граница плавно снижается к уровню случайного шума, что затрудняет измерение D .

Один из способов повышения объективности определения диаметра OTF заключается в том, чтобы измерять его (или радиус OTF, который обозначается как HWHM ) на половине максимальной яркости сигнала. Оценка разрешения микроскопа при этом будет несколько ниже максимального значения.

Другой способ состоит в использовании специальных препаратов, приготовленных из диатомовых водорослей и содержащих мелкие регулярные структуры на пределе разрешения микроскопа. В этом случае в Фурье-образе появляются контрастные рефлексы, которые значительно облегчают точное измерение диаметра OTF.

Рис. 7. Профиль яркости OTF от центра к периферии. HWHM - радиус OTF на уровне половины ее максимума (H alf W idth on H alf M aximum).

PSF и OTF непосредственно связаны с формулой Рэлея-Аббе. В свободном от аберраций микроскопе PSF обладает круговой симметрией и определяется выражением

где h(r) – это PSF, J 1 - функция Бесселя первого рода, a = 2pNA/l.

Таким образом, по крайней мере, в идеальном случае форма PSF определяется только двумя параметрами - длиной волны l и численной апертурой объектива NA. Аналитическое описание PSF может использоваться для повышения разрешающей способности микроскопа путем дополнительной обработки изображений на компьютере.

Elena 3013

В этой статье пойдет речь об увеличении микроскопа, единицах измерения данной величины, способах визуального определения разрешающей мощности прибора. Также поговорим о стандартных параметрах этого значения и способах расчета увеличения для конкретного типа работ.

Чаще всего основные параметры мощности микроскопа указываются на корпусе объектива. Выкрутите объектив и осмотрите его. Вы можете видеть две цифры, записанные через дробь. Первая – увеличение, вторая – числовая апертура.

Апертура характеризует возможность прибора собирать свет и получать четкое изображение. Также на объективе могут быть указаны длина тубуса и толщина покровного стекла, необходимые для работы.

Все об увеличении микроскопа

Увеличение измеряется в кратах (х). Взаимоотношение системы окуляр-объектив полностью определяет его значение. Произведение увеличения окуляра и объектива говорит нам о рабочем увеличении, которое создает данный микроскоп. Зависимость общего увеличения от увеличения объектива очевидна. По мощности объективы делятся на следующие группы:

Малые (не больше 10х);

Средние (до 50х);

Большие (более 50х);

Сверхбольшие (более 100х).

Максимальное значение увеличения объектива для оптического микроскопа – 2000х. Значение окуляра обычно равно 10х, оно редко меняется. А вот увеличение объектива варьирует в широких пределах (от 4 до 100х и 2000х).

Выбирая микроскоп, необходимо учитывать, кто на нем будет работать, и какое максимальное увеличение может понадобиться. Например, дошкольнику достаточно 200х, школьные и университетские микроскопы имеют увеличение от 400-1000х. А вот исследовательский прибор должен давать не менее 1500-2000х. Это значение позволяет работать с бактериями и мелкими клеточными структурами.

Цены в интернет-магазинах:

		Оксар.ру-Москва	900 Р
	Еще предложения

Разрешающая способность прибора

Отчего зависит четкость и качество картинки, которую дает микроскоп? На это влияет разрешающая способность прибора. Для вычисления этой величины нужно найти частное длины световой волны и двух числовых апертур. Следовательно, ее определяют конденсор и объектив микроскопа. Напоминаем, что значение числовой апертуры можно увидеть на корпусе объектива. Чем оно выше, тем лучше разрешение у прибора.

Оптический микроскоп имеет предел разрешения 0,2 микрона. Это минимальное расстояние до изображения, когда различимы все точки объекта.

Полезное увеличение микроскопа

Про полезное увеличение мы говорим, когда глаз исследователя полностью использует разрешающую способность микроскопа. Это достигается путем наблюдения за объектом под предельно допустимым углом. Зависит полезное увеличение только от числовой апертуры и типа объектива. При его вычислении числовая апертура увеличивается в 500-1000 раз.

Сухой объектив (между объектом и линзой только воздушная среда) создает полезное увеличение 1000х, т.е. числовая апертура равняется 1.

Иммерсионный объектив (между объектом и линзой слой иммерсионной среды) создает полезное увеличение 1250х, т.е. числовая апертура равняется 1,25.

Размытое или нечеткое изображение говорит о том, что полезное увеличение больше или меньше приведенных выше значений. Увеличение или уменьшение заданной величины значительно ухудшает работу микроскопа.

В этой статье мы говорили об основных характеристиках оптического микроскопа и методах их расчета. Надеемся, данная информация станет полезной при работе с этим сложным прибором.

Рассказать друзьям

Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т. п.) a электронные для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бактерий.
Современные световые микроскопы - это сложные оптические приборы, обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и большой аккуратности.
Световые микроскопы подразделяются на студенческие, рабочие, лабораторные и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой. Отечественные микроскопы (Биолам", "Бимам", "Микмед") имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С - студенческие, Р - рабочие, Л - лабораторные, И - исследовательские), комплектация обозначается цифрой.

В микроскопе различают механическую и оптическую части.
К механической части относятся: штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого
(микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.
Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также отдельного или встроенного осветителя. Объективы ввинчиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение, устанавливают с противоположной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.

Принципиальная схема микроскопа и осветительной системы

1. Источник света;
2. Коллектор;
3. Ирисовая полевая диафрагма;
4. Зеркало;
5. Ирисовая аппертурная диафрагма;
6. Конденбсор;
7. Препарат;
7". Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое; объективом;
7"". Увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в окуляре;
8. Объектив;
9. выходной значок объектива;
10. Полевая диафрагма окуляра;
11. Окуляр;
12. Глаз.

Основную роль в получении изображения играет объектив . Он строит увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, который аналогично обычной лупе дает увеличенное мнимое изображение.
Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не определяет качества изображения. Качество изображения, его четкость, определяется разрешающей способностью микроскопа , т. е. возможностью различать раздельно две близко расположенные точки. Предел разрешения - минимальное расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно,- зависит от длины волны света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива. Числовая апертура, в свою очередь, зависит от угловой апертуры объектива и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и препаратом. Угловая апертура-это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через объект. Чем больше апертура и чем ближе показатель преломления среды, находящейся между объективом и препаратом, к показателю преломления стекла, тем выше разрешающая способность объектива. Если считать апертуру конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет следующий вид:

где R - предел разрешения; - длина волны; NA - числовая апертура.

Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличенной в 500-1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным.
В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают «сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90-100 х). «Сухой» объектив - это такой объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом, находится воздух.

Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива. В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии-кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло. Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин. Ни в коем случае нельзя пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом.
**Изображение, полученное с помощью линз, обладает различными недостатками: сферической и хроматической аберрациями, кривизной поля изображения и др. В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки в той или иной мере исправлены. В зависимости от степени исправления этих недостатков различают объективы ахроматы и более сложные апохроматы. Соответственно объективы, в которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и планапохроматами. Использование этих объективов позволяет получить резкое изображение по всему полю, тогда как изображение, полученное с помощью обычных объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения. Все характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное увеличение, апертура, тип объектива (АПО - апохромат и т. п.); объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объективы масляной иммерсии-обозначение МИ и черное кольцо.
Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17мм.
Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (40 х). При работе с иммерсионными объективами нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм потому, что толщина покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива, и в этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может быть повреждена фронтальная линза объектива.
Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из которых применяется с определенным типом объектива, дополнительно устраняя недостатки изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.
Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусировать на препарате свет от осветителя, направляемый зеркалом микроскопа или осветителя (в случае использования накладного или встроенного осветителя). Одной из деталей конденсора является апертурная диафрагма, которая имеет важное значения для правильного освещения препарата.
Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания с толстой нитью, трансформатора, коллекторной линзы и полевой диафрагмы, от раскрытия, которой зависит диаметр освещенного поля на препарате. Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор. Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор, необходимо использовать только плоскую сторону зеркала.

Настройка освещения н фокусировка микроскопа

Качество изображения в значительной мере зависит также от правильного освещения. Существует несколько различных способов освещения препарата при микроскопии. Наиболее распространенным является способ установки света по Келеру , который заключается в следующем:
1) устанавливают осветитель против зеркала микроскопа;
2) включают лампу осветителя и направляют свет на плоское (!) зеркало микроскопа;
3)помещают препарат на предметный столик микроскопа;
4) закрывают зеркало микроскопа листком белой бумаги и фокусируют на нем изображение нити лампы, передвигая патрон лампы в осветителе;
5) убирают лист бумаги с зеркала;
6) закрывают апертурную диафрагму конденсора. Перемещая зеркало и слегка передвигая патрон лампы, фокусируют изображение нити на апертурной диафрагме. Расстояние осветителя от микроскопа должно быть таким, чтобы изображение нити лампы было равно диаметру апертурной диафрагмы конденсора (наблюдать апертурную диафрагму можно с помощью плоского зеркала, помещенного с правой стороны основания микроскопа).
7)открывают апертурную диафрагму конденсора, уменьшают отверстие полевой диафрагмы осветителя и значительно уменьшают накал лампы;
8) при малом увеличении (10х), глядя в окуляр, получают резкое изображение препарата;
9)слегка поворачивая зеркало, переводят изображение полевой диафрагмы, которое имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая конденсор, добиваются получения резкого изображения краев полевой диафрагмы в плоскости препарата (вокруг них может быть видна цветная каемка);
10) раскрывают полевую диафрагму осветителя до краев поля зрения, увеличивают накал нити лампы и слегка (на 1/3) уменьшают раскрытие апертурной диафрагмы конденсора;
11)при смене объектива необходимо проверить настройку света.
После окончания настройки света по Келеру нельзя изменять положение конденсораf раскрытие полевой и апертурной диафрагмы. Освещенность препарата можно регулировать только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата. Излишнее открытие апертурной диафрагмы конденсора может привести к значительному снижению контраста изображения, а недостаточное - к значительному ухудшению качества изображения (появлению диффракционных колец). Для проверки правильности раскрытия апертурной диафрагмы необходимо удалить окуляр и, глядя в тубус, открыть ее таким образом, чтобы она закрывала светящееся поле на одну треть. Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения (до 10х) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.
Внимание! При работе с объективами, дающими большое увеличение - с сильными сухими (40х) и иммерсионными (90х) системами, чтобы не повредить фронтальную линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая сбоку, опускают объектив макровинтом почти до соприкосновения с препаратом, затем, глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.

Уход за микроскопом

При работе с микроскопом нельзя применять большие усилия. Нельзя касаться пальцами поверхности линз, зеркал и светофильтров.
Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы тубуса от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе. При чистке внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной, не содержащей остатков мыла, полотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной чистым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики. Не рекомендуется протирать оптику объективов ксилолом, так как это может привести к их расклеиванию.
С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее резиновой грушей. Протирать их нельзя. Нельзя также самостоятельно развинчивать и разбирать объективы - это приведет к их порче. По окончании работы на микроскопе необходимо тщательно удалить остатки иммерсионного масла с фронтальной линзы объектива указанным выше способом. Затем опустить предметный столик (или конденсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.
Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо периодически протирать его мягкой тряпкой, слегка пропитанной бескислотным вазелином и затем сухой мягкой чистой тряпкой.

Помимо обычной световой микроскопии существуют методы микроскопии, позволяющие изучать неокрашенные микроорганизмы: фазово-контрастная , темнопольная и люминесцентная микроскопия. Для изучения микроорганизмов и их структур, размер которых меньше разрешающей способности светового микроскопа используют

Разрешающая способность микроскопа характеризуется величиной, обратной линейному пределу разрешения. Согласно дифракционной теории Аббе линейный предел разрешения микроскопа, т. е. минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, определяется по формуле

где линейный предел разрешения; длина волны света, в котором проводится наблюдение; А - числовая апертура, или просто апертура, микроскопа (микрообъектива).

Из формулы (324) следует, что для повышения разрешающей способности микроскопа нужно уменьшать длину волны света и увеличивать числовую апертуру микроскопа. Первая возможность реализуется путем фотографирования исследуемых предметов в ультрафиолетовом излучении.

Апертура микроскопа определяется по формуле где Значение апертурного угла современных высококачественных микрообъективов доведено практически до предела.

Другая возможность увеличения апертуры - применение иммерсионной жидкости, помещаемой между рассматриваемым предметом и микрообъективом. В качестве такой жидкости используют воду кедровое масло монобромнафталин

Чтобы глаз наблюдателя мог полностью использовать разрешающую способность микроскопа, определяемую по формуле (324), необходимо иметь соответствующее видимое увеличение. Если две точки передней фокальной плоскости оптической системы расположены друг от друга на линейном расстоянии (рис. 157), то

Рис. 157. Схема для определения полезного увеличения микроскопа

угловое расстояние между этими точками в пространстве изображений

Глаз наблюдателя будет воспринимать эти точки как раздельные, если угловое расстояние между ними будет не меньше углового предела разрешения глаза

Из формул (325), (324) и (317) следует, что видимое увеличение микроскопа

По последней формуле можно определить минимальное видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность микроскопа. Это увеличение называется полезным. При использовании формулы (326) следует иметь в виду, что во многих случаях диаметр выходного зрачка микроскопа составляет Это приводит к увеличению углового предела разрешения глаза до Если взять среднюю длину волны в видимой области спектра то при угловом пределе разрешения глаза согласно (326) для полезного увеличения микроскопа получим.

где l – расстояние между верхним фокусом объектива и нижним фокусом окуляра; L – расстояние наилучшего видения; равное 25 см; F 1 и F 2 – фокусные расстояния объектива и окуляра.

Зная фокусные расстояния F 1 , F 2 и расстояние между ними l можно найти увеличение микроскопа.

На практике не используются микроскопы с увеличением свыше 1500–2000, т.к. возможность различения мелких деталей объекта в микроскопе ограничена. Это ограничение обусловливается влиянием дифракции света, в проходящей структуре данного объекта. В связи с этим пользуются понятиями предела разрешения и разрешающей способности микроскопа.

Определение предела разрешения микроскопа

Пределом разрешения микроскопа называется то наименьшее расстояние между двумя точками предмета, при котором они видимы в микроскопе раздельно. Это расстояние определяется по формуле:

,

где λ – длина волны света; n – показатель преломления среды между объективом и объектом; u – апертурный угол объектива, равный углу между крайними лучами конического светового пучка, входящего в объектив микроскопа.

Реально свет от предмета распространяется к объективу микроскопа в некотором конусе (рис. 2 а), который характеризуется угловой апертурой – углом u между крайними лучами конического светового пучка, входящего в оптическую систему. В предельном случае, согласно Аббе, крайними лучами конического светового пучка будут лучи, соответствующие центральному (нулевому) и 1-му главному максимумам (рис. 2 б).

Величина 2nsin U называется числовой апертурой микроскопа. Числовая апертура может быть увеличена с помощью специальной жидкой среды – иммерсии – в пространстве между объективом и покровным стеклом микроскопа.

В иммерсионных системах по сравнению с тождественными "сухими" системами получают больший апертурный угол (рис. 3).

Рис.3. Схема иммерсионной системы

В качестве иммерсии используют воду (n = 1,33), кедровое масло (n = 1,514) и др. Для каждой иммерсии специально рассчитывают объектив, и его можно применять только с данной иммерсией.

Из формулы видно, что предел разрешения микроскопа зависит от длины волны света и числовой апертуры микроскопа. Чем меньше длина волны света и чем больше величина апертуры, тем меньше Z, а, следовательно, больше предел разрешения микроскопа. Для белого (дневного) света можно принять среднее значение длины волны λ = 0,55мкм. Показатель преломления для воздуха равен n = 1.

Микроскоп мбс-1

МБС-1 – cтереоскопический микроскоп, дающий прямое объемное изображение рассматриваемого предмета как в проходящем, так и в отраженном свете.

Микроскоп состоит из 4 основных частей:

– cтолик;

– штатив;

– оптическая головка с механизмом грубой подачи;

– окулярная насадка.

Столик микроскопа состоит из круглого корпуса, внутри которого вмонтирован поворотный отражатель с зеркальной и матовой поверхностями. Для работы с дневным освещением в корпусе предусмотрен вырез, через который свободно проходит свет. С задней стороны корпуса столика имеется резьбовое отверстие для работы с электрическим осветителем. На штативе микроскопа крепится оптическая головка – основная часть прибора, в которую вмонтированы наиболее ответственные оптические узлы.

В корпусе оптической головки помещен барабан с с установленными в нем галилеевыми системами. Вращением оси барабана с помощью рукояток с нанесенными цифрами 0,6; 1; 2; 4; 7 добиваются различного увеличения объективов. Каждое положение барабана четко фиксируется специальным пружинным фиксатором. С помощью рукоятки на штативе микроскопа, перемещающей оптическую головку, добиваются наиболее резкого изображения рассматриваемого объекта.

Вся оптическая головка может перемещаться по стержню штатива и закрепляться в любом положении с помощью винта. Окулярная насадка состоит из направляющей, представляющей прямоугольную деталь с двумя отверстиями для оправ объективов.

Наблюдая в окуляры нужно разворотом окулярных трубок найти такое положение, при котором два изображения сводятся в одно. Далее произвести фокусировку микроскопа на исследуемый предмет, а вращением отражателя добиться равномерного освещения поля. При настройке освещенности патрон с лампой перемещается в сторону коллектора до получения наилучшей освещенности наблюдаемого объекта.

В основном МБС-1 предназначен для препарировальных работ, для наблюдения объектов, а также для проведения линейных измерений или измерений площадей участков препарата. Оптическая схема микроскопа представлена на рис. 4.

Оптическая схема микроскопа МБС-1 представлена на рис. 4.

При работе в проходящем свете источник света (1) с помощью отражателя (2) и коллектора (3) освещает прозрачный препарат, установленный на предметный столик (4).

В качестве объектива применена специальная система, состоящая из 4-х линз (5) с фокусным расстоянием = 80 мм и 2-х пар галилеевых систем (6) и (7), за которыми находятся объективы (8) с фокусным расстоянием 160 мм, которые образуют изображение объекта в фокальных плоскостях окуляров.

Общее линейное увеличение оптической системы, состоящей из объектива (5), галилеевых систем (6) и (7) и объективов (8) составляет: 0,6; 1; 2; 4; 7. За объективами (8) установлены 2 призмы Шмидта (9), которые позволяют разворачивать окулярные трубки по глазу наблюдателя без разворота изображения объектива.

	1 – источник света; 2 – отражатель; 3 – коллектор; 4 – предметный столик; 5 – объектив (F = 80 мм); 6, 7 – галилеевы системы; 8 – объективы (F = 160 мм); 9 – призмы Шмидта; 10 – окуляры.
Рис. 4. Оптическая схема микроскопа МБС-1

К микроскопу МБС-1 прилагаются 3 пары окуляров (10) с увеличением 6; 8; 12,5 и один окулярный микрометр 8-кратного увеличения с сеткой. Они позволяют варьировать общее увеличение микроскопа от 3,6 до 88 (табл. 1). Общее увеличение микроскопа – произведение увеличения окуляра на увеличение объектива.

Таблица 1.

Оптическая характеристика микроскопа МБС-1

Увеличение	Увеличение объектива